Protein stability를 위한 단백질 및 peptide의 분해 경로(Degradation Pathways)에 대한 개요
바이오의약품의 안전성 및 유효성을 보증하기 위해 제조 직후 정의된 품질 특성을 유효기간동안 유지해야 한다.
protein stability 향상을 위하여 단백질 분해 경로에 대한 연구자료를 리뷰 하고자 한다.
온도, 운송 및 취급 등 물리적, 화학적 다양한 요소들이 바이오의약품의 protein stability and efficacy에 영향을 미친다.
단백질은 1차 아미노산 –> 2차구조 –> 3차 물리화학적 complex 를 형성함으로써 고유한 특성을 나타낼 수 있다. 그리고 경우에 따라 Sub-unit association 이라는 4차 요소가 작용할 수 있다.
단백질은 Glycosylated, phosphorylation같은 post-transnational modification이 일어나는데, 이런 작용들이 단백질의 잠재적인 분해경로 및 분해 동력학에 영향을 미치게 된다.
단백질은 일반적으로 solution chemistry에 민감하고, 좁은 범위의 pH 및 Osmolarity(삼투)에서만 안정적으로 형태를 유지한다. 특히나 시간이 지남에 따라서 support 해줄 수 있는 제제성분(formulation components)이 필요하다. 특히나 동결건조 제제는 degradation이 잘 발생하므로, 제제성분에 대한 고려가 필수이다.
단백질의 분해경로
- Chemical : covelent bond destruction(공유결합 파괴), oxidation(산화), deamidation(디아미데이션), reduction(환원), hydrolysis(가수분해).
- Physical in stability : Unfolding, dissociation(해리), denaturation, aggrigation(응집), precipitation(침전).
- Chemical + Physical in stabilit : Chemical적인 요소로써 1차 분해가 일어나면 그 분해산물과 2차 분해가 진행되는 것
주로 발생하는 단백질 분해 종류
oxidation, photodegradation, disulfide scrambling, deamidation, aggrigation, precipitation, dissociation, fragmentation
그 중, 몇가지 단백질 분해 종류에 대해 알아보고, 방지할 수 있는 방안에 대해 소개하겠다.
Oxidation: protein의 physicochemical(folding, subunit association)을 변경한다. 면역원성을 발생시켜 인체에 유해한 형태가 될 수 있다.
– 특정 환경에서 존재하는 O-radical이 amino acid와 반응할 수 있으며, 단백질 및 peptide에 치명적이다. 단백질 구조 중에 황이 있는 methionine 및 cysteine은 산화에 취약하며, 아로마틱 링이 있는 histidine, tryptophan 그리고 tyrosine 또한 산화에 취약하여 쉽게 산화된다.
– Light degradation: 빛에 의해 산화될 수 있으며, 산화를 통해 단밸질을 분해할 수 있다.
– Excipients, leachables: ex) phosphate-> methionine 산화 가속, 금속이온(1ppm 이상)->산화 가속
– Head space: HS 에 존재하는 산소(O2)는 바이알 내부 단백질의 산화를 일으킨다.
– Polysorbate, PEG: 계면활성제에서 peroxide 유입이되어 auto-Oxidation이 발생하거나, Oxidation 을 일으킬 수 있는데, 이는 HS의 O2 농도보다 더 심각한 영향을 줄 수 있다.
– Pre-filled syringe, Rubber stopper elastomer: 각각의 plastic에서 peroxide 유입 가능하다.
방지 대책
– Degassing(용존O2 제거)
– Redox potential 유지: thioredoxin, glutathione 등 투입
– 산화 대체제: 비타민C(Ascorbic acid), Methionine, Cysteine(금속이온이 없는경우)
– EDTA, citrate: 전이금속과 착물을 형성하여, 금속-촉매 산화 방지
– Mannitol, Glycerol, Ethylene glycole 등 polyol 사용
Deamidation: pH가 높을수록 잘 일어난다.
높은 pH 에서는 산소, 질소, 황 등 전기음성도가 높은 원자의 활성화가 일어나 (anionic-) Deamidation, deacylation 이 발생한다.
방지대책: Ethanol, PVP, 글리세롤 등의 solvent를 사용하여 dielectric strength를 낮추면 deamidation이 발생할 확률이 낮아진다.
Aggrigation, Precipitation: 보존제 등을 사용하여 제제의 소수성 증가, 온도 증가로 인한 구조 변형
–> 보존제 사용을 통해 제제의 소수성이 증가하면, 단백질의 수용성에 영향을 미치고, 단백질이 부분적으로 펼쳐진 형태를 선호한다. 완벽하게 folding된 구조가 변형되면 응집이 유도될 수 있다.
–> 온도가 증가하면 단백질의 열역학적 에너지를 상승시키고, 엔트로피가 증가하는 방향으로 구조적 변형을 일으킬 수 있다. –> 구조적 변형은 응집을 유도할 수 있다.
방지 대책: 용액 pH 및 이온강도의 최적화(?)를 통해 응집 및 침전에 대해 안정화를 해야한다.
당, 아미노산, 폴리올, 계면활성제(양친매성-HLB 조절) 등은 응집을 방지할 수 있다.
또한 poloxamer는 열에 대한 안정화에 기여한다.
Fragmentation, Hydrolysis: pH가 낮을 때 유도되는 경향이 있다.
– 산성 및 염기성 가수분해가 있으니 각각에 대하여 산도를 조절함으로써 방지해야 한다.
[참고]
Stability Considerations for Biopharmaceuticals: Overview of Protein and Peptide Degradation Pathways View PDF
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